Ya en otra publicación les había comentado la capacidad contaminante que tienen las aguas residuales de la industria láctea y también que el lactosuero generado como subproducto en la elaboración de quesos podía ser utilizado como sustrato para la obtención de enzimas lipolíticas (también llamadas lipasas). Ahora en esta publicación quiero comentarles como estas lipasas fueron evaluadas como una etapa de tratamiento para las aguas residuales de una industria láctea.

Las aguas residuales de estas industrias además de contener una elevada carga orgánica tienen un alto contenido de grasa, lo que afecta negativamente el tratamiento de los efluentes en sistemas de tratamiento biológico, debido a la baja tasa de degradación que estas presentan, con lo que tienen a causar obstrucciones y malos olores en las unidades de tratamiento. Una alternativa para evitar estos problemas es la implementación de una etapa de tratamiento previo en la cual se reduzca el contenido de grasas y materia orgánica que contiene el efluente antes de que ingresen al sistema de tratamiento biológico.

Fuente: propia

Existen diversos métodos convencionales para cumplir con este propósito de adecuar el efluente a tratar para su ingreso en unidades de tratamiento biológico, métodos físicos como la filtración y decantación, o químicos como la coagulación, pero estos implican el consumo de reactivos costosos, operan con baja eficiencia o generan como subproductos sólidos o mezclas que también resultan peligrosos para el ambiente. Por lo que el tratamiento vía catálisis enzimática puede ser una opción más rentable y limpia comparada con estos métodos, por ello, y para evitar la dependencia de productos importados, se pueden emplear enzimas obtenidas a partir de sustratos derivados de desechos agroindustriales.

Determinación de los parámetros cinéticos

Evaluar la cinética de una enzima procede como para cualquier otra reacción, es decir, estableciendo la relación entre las concentraciones del sustrato (S) y la velocidad de la reacción (v), en este caso particular la reacción fue seguida mediante la hidrólisis de las grasas presenten en el agua residual. Y aunque existen varios modelos posibles para la catálisis enzimática, el más sencillo de evaluar es el modelo propuesto por Michaelis-Menten, mediante la siguiente ecuación:

Donde, V_max es el término conocido como velocidad máxima (μmol/mL*min) y K_M es la constante de Michaelis-Menten.

Para el trabajo se empleo un extracto enzimático compuesto de enzimas lipolíticas, obtenido de la fermentación en medio líquido con Rhizopus spp utilizando propio lacto suero como sustrato. La obtención de estas enzimas por esta vía la compartí con ustedes en una anterior publicación (pueden consultarla aquí).

Una vez disponibles las enzimas microbianas, la determinación de la actividad enzimática en muestras de agua residual se estableció empleando el extracto enzimático libre en el sistema, para diferentes concentraciones de sustrato.

Preparación del sustrato a diferentes concentraciones. Fuente: propia.

Y para evaluar la cinética proceso se mide la cantidad de ácidos grasos liberados mediante titulación directa con NaOH durante la reacción de hidrólisis de los triacilgriceroles, usando fenolftaleína como indicador.

Determinación de la concentración de ácidos grasos. Fuente: propia.

Para ello se emplea la siguiente ecuación:

Para determinar la velocidad inicial de la reacción, luego se construye una gráfica de concentración de ácidos grasos liberados frente al tiempo establecido para la reacción. La velocidad inicial corresponde a la pendiente de la recta ajustada a región lineal del gráfico.

Para conocer los valores de V_max y K_M, estos se obtienen de forma experimental, determinando la velocidad inicial de la reacción para las diferentes concentraciones del sustrato seleccionadas (600, 400, 200 y 100 ppm), y ajustando los datos a la forma lineal de la expresión de Michaelis-Menten conocida como representación de Lineweaver-Burk, mediante la siguiente expresión:

De este modo, mediante una gráfica donde se relacionan 1/v frente a 1/[S], se pueden determinar las constantes de la ecuación de Michaelis-Menten.

Resultados

Características del agua residual

La muestra de agua residual empleada para el estudio fue recolectada de una tanquilla que recolecta los efluentes de la empresa.

Muestra de agua residual. Fuente: propia.

La misma tenía las siguientes características.

Fuente: propia.

Estimación de los parámetros de la ecuación de Michaelis-Menten

La velocidad inicial de reacción se determinó a partir de la pendiente de la gráfica de concentración de ácidos grasos frente al tiempo. Para una concentración de 600 mg/L el resultado se muestra en la siguiente gráfica.

µmoles de ácido graso liberado/mL vs. Tiempo de reacción Fuente: propia.

Los resultados de la velocidad de reacción a las diferentes concentraciones del sustrato se muestran en la siguiente gráfica,

Velocidad inicial de reacción a diferentes concentraciones de sustrato. Fuente: propia.

Por el ajuste de los datos se concluye que los resultados pueden ser modelados por la ecuación de Michaelis-Menten, por lo cual se puede emplear el modelo linealizado de Lineweaver-Burk para determinar las constantes de la expresión.

Representación de Lineweaver-Burk para la estimación de los parámetros cinéticos. Fuente: propia.

En la siguiente tabla se muestran los resultados de Km y Vmax para la enzima libre en la reacción de hidrólisis de las grasas presentes en el agua residual.

Fuente: propia.

Tratamiento enzimático del efluente

El tratamiento enzimático del agua residual condujo a los siguientes resultados.

Fuente: propia

Con del tratamiento enzimático se logró una remoción del 49% de la materia orgánica expresada como DBO5 y de 52% de las grasas presentes en el efluente. Lo que confirma que un pretratamiento catalítico enzimático puede ser empleado para el acondicionamiento de efluentes para este tipo de empresas, lo que permitiría mejores rendimientos en las etapas de tratamiento posteriores.

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Consideraciones finales

• El experimento demostró que la reacción catalizada se ajustó al modelo de Michaelis-Menten, y mediante el procedimiento experimental se logró determinar las constantes de la ecuación, siendo K_M igual a 172,13 mg/L y V_max 0,832 μmol/mL.min.

• Los valores de las constantes resultaron bajos comparados con otros sistemas donde se han tratado aguas residuales de industrias de alimentos, sin embargo se espera ahondar en optimizar las condiciones de reacción para mejorar estos parámetros. Sin embargo, el valor de K_M podría sugerir una fuerte afinidad de la enzima por el sustrato, lo que indica que el complejo enzima-sustrato se una fuertemente.

• La experiencia permitió evaluar el extracto enzimático en el tratamiento de aguas residuales de la producción de quesos, los resultados de la remoción de grasa y disminución de la DBO₅ permiten confirmar que estos biocatalizadores pueden ser implementados en una etapa de pretratamiento de estos efluentes.

• El tratamiento de estos efluentes mediante la catálisis enzimatica con lipasas microbianas surge como una alternativa viable y amigable con el ambiente. Y resulta más económica si se pueden emplear enzimas derivadas del mismo sustrato a tratar.

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Espero mis amigos que la información les sea de utilidad y quede a su alcance si requieren el procedimiento para evaluar la cinética de una reacción catalizada por enzimas. ¡Saludos!

Referencias.

Levine, I. (2004). Fisicoquímica. Quinta edición. Vol. 2. MacGraw-Hill.

Cinética de Michaelis-Menten