El rompimiento del ADN, con enzimas de restricción es uno de los procedimientos más empleados en Biología Molecular, estas endonucleasas bacterianas catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiester de secuencias de bases palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones) específicas de la molécula de ADN de doble cadena, fragmentando así un segmento de ADN.

Las enzimas de restricción, permiten cortar el genoma de cualquier organismo en pequeños fragmentos llamados fragmentos de restricción, en el caso de la enzima Sau3, reconoce la secuencia 5'-GATC-3', digiriendo en el lado 5' de la G, generando extremos cohesivos, lo que indica que realiza cortes de manera escalonada.

Por consiguiente, y en busca de lograr socializar el contenido de este post, mostraré un ejercicio práctico, que permita una mejor comprensión de cómo las enzimas de restricción cortan el ADN de cepas de Trichoderma, y al mismo tiempo visualizar el ADN cortado por la enzima de restricción Sau3, a través de electroforesis en gel de agarosa, actividad que pude ejecutar en el Laboratorio de Investigaciones Genéticas del Decanato de Postgrado de la Universidad Nacional Experimental del Táchira, San Cristóbal, Venezuela.

La extracción del ADN de las cepas de Trichoderma se la realizó utilizando el protocolo de Lana, (2004).

El ADN genómico de cada cepa, fue digerido con la enzima Sau3 (Promega) utilizando un volumen de reacción de 20 μL, que contenía: 6 µL de ADN; 2 µL de Buffer (10X); 0,5 µL de la enzima de restricción Sau3; 11,3 µL de H2O y 0,2 µL de Seroalbúmina bovina; luego se incubaron a 37°C por 2 horas.

El digerido del ADN de cada cepa se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % de solución TAE 1X; luego se colocó en cada pozo 10 µL de muestra más 2 µL de Buffer de carga (pozo 1. LIG 006A, pozo 2 LIG006B, pozo 3 LIG 006D, pozo 4 LIG022E, pozo 5 Control); la electroforesis se realizó a 120 voltios durante 15 minutos aproximadamente; el ADN se visualizó en un transiluminador de luz ultravioleta LADNEL Dual IntensityUV y se fotografiaron.

En la figura 1, se muestra la imagen electroforética en gel de agarosa al 1 %, obtenida a partir de la digestión de ADN Trichoderma sp, cepas LGI06A, LGI06B, LGI022D y LGI022E, observándose patrones de restricción diferentes de fragmentos del ADN genómico de Trichoderma sp, lo que indica que posiblemente estas cepas no son genéticamente iguales, para poder corroborarlo lo recomendado, es realizar nueva digestión con otras enzimas de restricción, información que compartiré en un siguiente post.

Amigos de Steemit, observen las celdas de las 5 muestras que aparecen en el lado que dice sin digerir (derecho), si lo detallan se ven las bandas de ADN claramente definidas en la parte superior del gel, pero estas bandas desaparecen en las muestras del lado izquierdo indicando la digestión del mismo.

La técnica de restricción del ADN, permitió digerir el ADN genómico de Trichoderma sp, cepas LGI06A, LGI06B, LGI022D y LGI022E con la ayuda de la enzima de restricción Sau3, por lo que se recomienda su uso como técnica molecular para la caracterización genética de Trichoderma sp.

ADN: Se refiere al ácido desoxirribonucleico, que contiene toda la información a nivel genético de un organismo.

ADN genómico: Es el conjunto de ADN que constituye el genoma de un organismo.

Biología molecular: Área científica, basada en el estudio detallado de los procesos funcionales, que intervienen en los organismos, mediante el uso de técnicas moleculares.

Digestión de ADN: Cortes en sitios específicos, que se ejecutan en la molécula de ADN, mediante técnicas moleculares.

Electroforesis: Dícese de las técnicas moleculares, utilizadas con el objeto de separar y purificar moléculas.

Endonucleasas: Son enzimas de restricción derivadas de eubacterias y arqueas, que presentan la capacidad de reconocer secuencias de ADN específicas.

Enlace fosfodiéster: Tipo de enlace covalente, generado entre un grupo de azúcar y un grupo fosfato, convertido en el esqueleto del ADN.

Enzimas: Se conoce por enzimas, a las proteínas que participan y catalizan reacciones químicas.

Enzimas de restricción: Dícese de las enzimas, que tienen la capacidad de reconocer una secuencia especifica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN.

Extracción de ADN: Se conoce como extracción de ADN, a la actividad de obtener por medio de técnicas moleculares ADN a partir de material biológico.

Genoma: Se refiere al conjunto de genes en los cromosomas.

Trichoderma sp: Microorganismos de la división Ascomycota, cuyas especies se pueden diferenciar entre sí, por los órganos de esporulación asexual.

Lana, T. (2004). Caracterizacao genetica e fisiologica de Crinipellis perniciosa. Tesis Dr. Agronomía, Sao Paulo, BR, USP. 106 p.

Suárez, O., Montero, G., Maestre, J., Díaz, M., Lugo, O. (2004). Uso del análisis de restricción en el control de calidad de cepa del biolarvicida cubano BACTIVEC. REV CUBANA MED TROP. 56(2):145-7.

López, A. (2007). Manual de prácticas de biología molecular: Técnicas básicas. División: Ciencias Biológicas y de la Salud. 47 p.

Sarasola, V. (2007). Aislamiento y caracterización de microsatélites a partir de la construcción de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina. ARANZADI. 15p.