바이러스학 실험 – plaque assay

plaque assay는 바이러스의 역가(ti-ter)검정법 중 하나이며, Phage의 경우는 적당히 희석한 파지액과 감수성 지시균(Sensitivity indicator strain)을 용해한 agarose에 혼합시킨 후, 이것을 Agar plate에 중층하여 배양하면, 생육한 지시균이 파지에 의해 용균되어 원형 용균반을 형성합니다. 이것을 용균반점형성단위(PFU)로 나타냅니다. 다른 바이러스의 경우는 단층으로 배양시킨 동물세포상에서 형성될 수 있는 용균반으로 표시합니다. Virus의 종류에 따라 감염시키는 방법이 다른데, Animal virus (issue culture infection, plant virus), Plant virus (leaves infection), Bacteriophage (lytic infection plaque 형성, lysogenic infection Cloudy plaque 형성)로 나뉘는 것을 우리는 잘 알고 있습니다.

이번 실험에 사용한 균주는 Klebsiella pneumonia로 폐렴균입니다. Gram negative Bacillus으로 편모(Flagellum), 포자(Spore)는 없고 협막(Capsule)을 가지고 있습니다. 보통 Agar에 잘 발달하는 통성혐기성균(Facultative anaerobe)입니다. 이 균주는 사람의 장관내(Intestine), 구강(Mouth) 등에 상재하고 있는데, 급성 폐렴(Acute pneumonia)의 원인균(Pathogen)이 되며 기관지 폐렴의 10~20%는 이 균에 의해 발생됩니다. 또한 요로감염증(Urinary tract infection)에서 분리되는 경우도 있습니다.

실험을 위해서 Klebsiella pneumonia(Host), PBST32Φ(Phage), LB Medium(0.7% Agarose gel), PDA, PDB, Incuabator, Shaker, Beauveria bassiana Korea #5540를 준비해 줍니다.

먼저 Soft Agar를 만들어 멸균처리를 한 후 3ml를 Bacteria 100ul과 Mix 시킵니다. LB를 이용하여 Dilution 한 후, Voltexting 처리를 하여 dilution 용액을 만듭니다. 이 후 plaque를 측정해냅니다.

agar plate를 만들 때, magnetic bar로 shaking을 잘 해주지 않을 시에는 균일하게 섞이지 않아 배지가 찢어지는 경우가 있으며, 배지를 pouring 할 때 양에 따라서 배양정도가 달라지는데, petry dish의 뚜겅을 닫았을 때 아래 부분까지 얇게 펴서 부어주었을 때, 배지가 찢기지 않고, streaking이 잘 됩니다.

접종할 때에는 loop를 불에 달구어 멸균상태로 만든 후, agar를 녹여서 배지에 접종하는데, 이때 오염이 되지 않도록 clean bench에서 알코올 램프와 함께 실험해야 합니다.