생화학 실험 – IPTG induction for TEV protease overexpression (Power Up 100%)
이번 실험에서는 TEV protease-expression vector를 가진 E.coli의 expression strain에 농도별로 IPTG를 처리하여 TEV protease를 overexpression 하는 것이 목적입니다.
먼저 단백질 발현에 사용되는 E.coli strain (Rosetta(DE3))에 TEV protease를 삽입한 pET-21a(+)를transformation 합니다. Transformation으로 얻은 colony를 LB 액체배지 5ml(+Ampicillin 50µg/ml, Chloramphenicol 34µg/ml)에 접종하여 37’C에서 overnight로 배양합니다. LB 액체배지 10ml(+Amp,Cam)에 배양액 100µg를 접종합니다.
그 다음 주기적으로 O.D 값을 측정하여 0.2~0.5 (3조: 0.23)가 될 때까지 37’C에서 shaking incubation을 해줍니다. O.D 값이 0.2 ~ 0.5가 되면 15ml tube 4개에 남은 배양액을 2ml씩 넣습니다. 2ml의 배양액이 들어있는 15ml tube 각각에 IPTG를 0mM, 0.1mM, 0.3mM, 0.5mM 로 넣고 induction을 해줍니다.
여기서 IPTG의 농도를 여러 가지로 처리하는 이유는 IPTG를 처리할 때에는 cell마다 특징이 다르므로 발현이 잘 되는 유전자라도 최적의 조건이 되지 않으면 발현이 잘 되지 않기도 하여, 그 조건을 맞추기 위해서 IPTG 농도, IPTG 처리 전/후의 배양 온도, IPTG 처리 시간 등을 비교해가며 실험해 보아야 합니다.
IPTG 처리 후 2시간 후에 1ml만 cell harvest를 합니다. 실험의 편의상 IPTG 처리 후, 2시간이 경과한 후에 cell을 얻었지만, 정확한 실험을 위해서는 다양하게 시간처리하여야 합니다. IPTG의 induction은 IPTG의 농도, IPTG의 처리 전/후의 배양온도, IPTG 처리 시간에 의해 활성이 달라지므로, 최적의 조건을 찾기 위해서 시간 조건도 다양하게 처리하여야 합니다. 하지만 실험 시간의 제한이 있는 관계로 처리시간을 2시간으로 동일하게 지정하여 실험하였습니다. harvest한 cell은 1X TE buffer 500ug로 washing 후 –80‘C에 보관합니다.
What is your goal with the TEV protease? Are you working with fusion proteins? Did the IPTG help with your transcription rate. Do you have the facility to do rt-qPCR?
Kr: (google)
TEV 프로테아제의 목표는 무엇입니까? 융합 단백질로 일하고 있습니까? IPTG가 귀하의 필사적 인 속도에 도움이 되었습니까? rt-qPCR을 할 수있는 시설이 있습니까?
English translation:
The purpose of this experiment is to overexpress TEV protease by treating IPTG with a concentration-dependent expression strain of E. coli with a TEV protease-expression vector.
Transform pET-21a (+) with TEV protease into the E. coli strain (Rosetta (DE3)) used for protein expression. The colony obtained by the transformation is inoculated into 5 ml of LB liquid medium (+ Ampicillin 50 μg / ml, Chloramphenicol 34 μg / ml) and incubated overnight at 37 ° C. Inoculate 100 μg of culture medium into 10 ml of LB liquid medium (+ Amp, Cam).
Then periodically measure O.D. and shake incubate at 37 ° C until 0.2-0.5 (trillion: 0.23). When the O.D value becomes 0.2 ~ 0.5, put 2ml of the remaining culture in 4 15ml tubes. Incubate IPTG in 0.1 ml, 0.1 mM, 0.3 mM, 0.5 mM in each 15 ml tube containing 2 ml of culture solution.
Here, the reason why the concentration of IPTG is treated in various ways is that when the IPTG treatment is performed, the characteristics of each cell are different. Therefore, even if a gene having a well-expressed gene is not optimal, the expression may not be satisfactory. Experiment with comparing the incubation temperature before and after IPTG treatment and IPTG treatment time.
After 2 hours from IPTG treatment, 1ml cell harvest is done. For the convenience of experimentation, the cell was obtained after 2 hours of IPTG treatment. The induction of IPTG varies depending on the concentration of IPTG, the incubation temperature before and after treatment of IPTG, and the treatment time of IPTG. Therefore, time conditions must be varied in order to find optimal conditions. However, since there is a limitation of the experiment time, the experiment was performed by specifying the same treatment time as 2 hours. Harvest the cells by washing with 1X TE buffer (500 μg) and store at -80 ° C.