바이러스학 실험 – Cesium Chloride density gradient

Cesium Chloride density gradient 기법은 주로 DNA나 바이러스 입자 등의 분리와 분석용으로 염화세슘(CsCl)을 사용한 등밀도 원심분리법 또는 평형밀도기울기원심분리할 때 이용합니다. 밀도를 정확하게 측정할 경우에는 분석용 초원심기를 사용하지만 일반적으로 조작이 간단하고 응용범위도 넓은 분리용 초원심기를 사용합니다. 직선 2중나선 DNA의 염화세슘에서의 밀도와 염기조성사이에는 “인 경험식”이 있어 보통 DNA에서는 1.7값을 가집니다. RNA의 경우 밀도가 DNA보다 훨씬 높아 염화세슘의 용해도를 초과하기 때문에 좀 더 수화하여 밀도가 낮아지는 황산세슘을 이용한 원심분리를 할 수 있습니다. 밀도나 염기조성의 결정 외에도 알칼리 용액 내에서의 원심분리에 의한 DNA상보사슬의 분리나 밀도가 큰 안정성동위원소(2H, 13C, 15N)나 5-bromo-uracyl 등의 염기 유사체를 끼어 넣어 DNA를 밀도 표지함으로써 좀 더 새롭게 복사된 DNA분리를 목적으로 이용하고 있습니다. 또 플라스미드나 바이러스의 폐쇄고리형 2중나선 DNA를 정제할 때에 EtBr (Ethidium bromide)을 포함한 염화세슘밀도구배원심분리를 이용하고 있습니다.

Refractometer는 빛에 대한 물질의 굴절률을 이용하여 수용액의 농도를 측정하는 장비입니다. 일반적으로 한 두방울의 적은 양의 시료액을 통해서 음식, 농장물, 음료수, 화학 약품, 산업용 기름 등을 쉽고 간편하게 측정할 수 있습ㄴ디ㅏ. 굴절지수 (nD)를 사용하여 빛의 방향이 변화하는 각도(굴절각)를 비교하여 시료액의 농도를 측정할 수 있습니다. 굴절계 내부의 프리즘은 수용액보다 더욱 큰 굴절 지수를 가지고 있으며, 측정은 아래의 그림과 같이 프리즘과 수용액이 만나는 곳에서 이루어집니다.

ㆍ묽은 시료 일 때는 프리즘과의 사이에 굴절율차가 크게 되어 크게 굴절한다 → A
ㆍ짙은 시료 일 때는 프리즘과의 사이에 굴절율차가 적게 되어 작게 굴절한다 → B

먼저 5ml Pp tube에 30% phosphate buffer 21ml, 9g의 cesium을 넣습니다. Refractometer를 통해 밀도를 계산합니다. R.I를 재가며 우리조가 맡은 밀도인 1.350 값으로 tube의 용액을 맞춥니다. 1 O.D를 넣고 Swing bucket 55을 이용하여 centrifugation 합니다. Fraction collector를 이용하여 virus peak를 관찰합니다.

deacc=0은 coast down to stop 진공상태이여서 멈추는데 오래 걸립니다. break을 주면 cell이 다 깨지므로 절대 주지않도록 합니다. 밀도가 높으면 바이러스 유전자가 많다는 뜻입니다.

sucrose density를 할 경우 바이러스를 한번 정제한 것이기 때문에 여러 바이러스 불순물이나 조각들이 함께 검출되어 피크가 여러 개가 뜨지만, cesium chloride로 한 번 더 걸러 줄 경우에는 순수한 바이러스 메인 피크만 얻어낼 수 있습니다.