분자생리학 실험 – 세포배양이론 및 기초

세포배양의 이론을 알고 실험해보기 위해 진행하였다.

1. 세포 배양에 있어서 혈청의 역할

1. 세포의 성장과 기능에 관여하는 호르몬을 제공한다.
2. 세포의 부착과 확산인자를 제공한다. 또한 증식 환경에 있는 독성 성분을 부착 및 중화시킨다.
3. 호르몬, 중금속, 지질 등의 운반 단백질을 제공한다. (광범위한 고분자 단백질, 저분자 영양분, 불용성 물질 등의 운반체)

1. 혈청의 불활성화
   세포배양에 있어 혈청을 불활성화시키는 효과에 대해서 많은 논란이 있었지만 많은 실험실에서 혈청을 불활성화시켜 사용하고 있다. 가장 많이 쓰이는 방법은 56‘C에서 30분동안 열불활성화를 하는 것이다. 혈청의 불활성화는 주로 열에 불안저한 성분, 즉 혈청보체계를 없애기 위해 시행한다.

2. 실험 재료 및 도구

1. 실험 재료 : HEK 298 cell, 100mm culture dish, 60mm culture dish, 15 conical tube, Trypsin-EDTA, DMEM (10% FBS)
2. 실험방법
   ① 세포 내 media를 suction을 통해 제거한다.
   ② cell에 trypsin-EDTA를 2ml 처리한다.
   ③ CO2 incubator에 5분간 넣어둔다.
   ④ cell을 15ml conical tube로 옮긴다.
   ⑤ 2000 rpm에서 5분간 centrifuge 돌린다.
   ⑥ trypsin을 suction으로 제거 후, DMEM 1ml로 resuspension 한다.
   ⑦ 새로운 60mm culture dish로 옮긴 후, CO2 incubator에서 배양한다.

1. 토의
   동물세포 실험을 할 때에는 냉장고 및 freezer에서 보관하다 사용 전 비슷한 온도의 물에 담가 온도를 안정하게 해준 뒤 실험을 진해해야 한다. 우리가 사용한 HEK293 cell은 Human Embryonic Kidney 로 단단하며 형질도입이 쉬운 세포이다. 부착형 모양이다가 죽을 경우 떠다니는 형태로 바뀌는데 이를 anoikis라고 한다. 실험과정 2에서 cell에 trypsin-EDTA를 처리하는데 EDTA에 의해 Ca2+ ion을 제거하고, trypsin에 의해 단백질을 자르는 역할을 한다. 이후 incubator에서 5분간 배양하는데 우리는 CO2 incubator를 사용하였다. CO2 incubator는 5%의 CO2를 혼합한 공기를 내보내는데 이는 배지 내의 CO2를 빠져나오지 않게 눌러주는 역할을 한다. 이후 conical tube로 옮겨 물리적으로 세포를 떨어뜨리기 위해 pipetting 한다. 5분간 centrifuge에 돌리면 위에는 trypsin이, 아래에는 cell이 생기는데 위의 trypsin을 suction으로 제거해주고, DMEM으로 resuspension한다. 단일세포로 만드는 것이 중요하기 때문이다. 우리 실험에 쓰인 DMEM은 BME의 변형된 형태 중 하나로 가장 널리 사용되는 배지이다. BME에 비해서 아미노산이 4배 정도 많고, ferric nitrate가 더 첨가되어 있다. 배지가 붉은색을 띄는 이유는 phenol red 성분 때문인데 지시약으로 pH마다 색이 변한다. 세포는 증식을 하면서 많은 노폐물을 배설하는데, 이물질들이 배지를 산성으로 만들기 때문에 배지의 색을 보고 생육조건을 추측할 수 있다. 배지에는 배지의 10% 만큼 혈청을 넣어주는데 주로 FBS(Fetal Bovine serum, 우태혈청)을 사용한다. 혈청을 배지에 넣는 이유는 세포가 잘 배양되도록 영양성분, 비타민 등의 공급원이 되고, 호르몬, 세포성장인자, 등의 공급원이 되며, 증식 저해물질을 중화 저해하는 역할을 하기때문이다. 사용 시 56‘C에서 30분간 열불활성화를 해주어 혈청보체계를 없애준다. 모든 실험은 clean bench 안에서 알코올램프를 키고, 실시간 손소독을 해가며 해야하는 민감한 실험이므로 영양분이 풍부한 배지에 다른 균주나 곰팡이가 감염되지 않도록 주의하며 실험해야 한다.